適用于激光熒光顯微鏡的光學濾光片
介紹
因為激光具有高亮度、穩(wěn)定、長壽命及譜線窄等特性,它正逐漸取代了熒光成像應(yīng)用中的傳統(tǒng)寬帶 光源。在成像應(yīng)用中,激光的上述特性可提高可視化的靈敏度,也增加了光通量;激光更具有光束發(fā)散 角窄、高度的時空相干性、偏振特性明確等獨/有特性,從而催生了眾多新的熒光成像技術(shù)。然而,相對 于寬帶光源,當激光以熒光光源的形式出現(xiàn)時,為基于激光的成像系統(tǒng)(如共聚焦和全內(nèi)反射熒光(TIRF) 顯微鏡)及其組件提出了新的限制要求。尤其是對光學濾光片有著更特殊的要求。
針對激光光源進行優(yōu)化的光學濾光片
在過去四十多年里,已開發(fā)出了許多強大、高效且性價比好的激光器。人們通常按增益介質(zhì)和激勵 方式對激光器進行分類。至今,受歡迎的用于熒光成像的激光器仍為氣體激光器(如氬離子和氪離子 激光器)常用的激光譜線為488、568和647nm。但在最近幾年,由于固態(tài)激光器的(電光轉(zhuǎn)換)效率明 顯更高(產(chǎn)生的熱量更低,實驗室安裝更加簡單)、尺寸更小,且成本更低,因此正在逐漸取代了體激 光器。比較流行的激光器類型包括半導(dǎo)體二極管激光器(尤其是405和635nm)、光泵浦半導(dǎo)體激光器(包 括廣泛使用的488nm),以及倍頻二極管泵浦固態(tài)(DPSS)激光器(包括561nm的黃光激光器和較新的515nm 和594nm激光器)。表1總結(jié)了在熒光成像應(yīng)用中最/受歡迎的激光器。
激發(fā)濾光片:盡管尚有異議,但針對激光光源的消雜濾光片(激發(fā)濾光片)是十分重要的,可用它 阻擋不想要的非激光線波長的光,包括固態(tài)激光器中自發(fā)發(fā)射和氣體激光器的等離子線。這些濾光片不 僅要能夠濾掉的無用光(> OD 6),對于激光線也應(yīng)具有高透過率(T>95%)(請參見圖1和3)。此外, 這些濾光片還要耐用,以承受高強度的激光束的照射。
與沿用了幾十年的傳統(tǒng)軟鍍膜的熒光濾光片不同,通過離子束濺射制作的新型硬鍍膜的薄膜濾光片 具有很高的激光損傷閾值(LDT)等級。Semrock 生產(chǎn)的的激光濾光片通常具有 1 焦耳/平方厘米或更高 的 LDT 等級,適用于強脈沖激光。對于連續(xù)(CW)激光器,該 LDT 等級相當于 10-100 千瓦/平方厘米。 此外,硬鍍膜濾光片幾乎不受溫度和濕度引起的環(huán)境退化的影響;由于具有高光學耐久性以及穩(wěn)固的環(huán) 境可靠性,在大多數(shù)熒光顯微鏡應(yīng)用中無需更換濾光片。
表1:常用熒光激光器
“DPSS”= 二極管泵浦固態(tài)激光器“OPS”= 光泵浦半導(dǎo)體激光器“倍頻”= 通過非線性光學晶體實現(xiàn)倍頻
用于激光器的激發(fā)濾光片還具有*的波長要求。有些激光器,如氣體激光器和DPSS激光器,具有非 常精確和窄的激光譜線。適用于特定激光譜線的理想激發(fā)濾光片為窄帶激光譜線濾光片(典型帶寬<激光 波長的0.4%),關(guān)鍵在于激光譜線的精確定位。Semrock的MaxLine®激光譜線消雜濾光片是該應(yīng)用的理想 選擇。但是,此類濾光片不適用于使用類似波長的多激光器的系統(tǒng)(如:激發(fā)GFP的473nm和488nm的激光 器,或?qū)砜赡苌壍?61nm DPSS激光的568nm氪離子激光器),也不適用于半導(dǎo)體激光器系統(tǒng)。
對于二極管和光泵浦半導(dǎo)體激光器來說,同一型號的激光器,因為溫度和使用年限的不同,每臺的光 譜輸出都會不同。因此,對于大多數(shù)此類激光顯微系統(tǒng)來說,采用與寬帶光源(如弧光燈)顯微系統(tǒng)類似 的寬帶激發(fā)濾光片是一個不錯的解決方案。例如,圖1所示的激發(fā)濾光片設(shè)計用于375nm和405nm的激光器, 而405nm激光器的長波邊緣需考慮±5nm的不確定性。但是,這些激發(fā)濾光片與寬帶光源濾光片并不*一 樣。濾光片除了精確定位相關(guān)激光器波長的邊緣位置,還需考慮其它重要因素,包括邊緣陡度和通帶紋波。 因為低紋波可確保特定激光譜線的高速傳輸,或隨著時間的推移,當半導(dǎo)體激光器的波長產(chǎn)生漂移時,陡 邊緣可提供很高的光學噪聲的區(qū)分。
圖1:測量典型的激光熒光濾光片組測得的光譜性能;
藍色線 - 激發(fā)濾光片;綠色線 - 分色濾光片;紅色線 - 發(fā)射濾光片
發(fā)射濾光片:可對所有可能用于此濾光片組的激光線,典型的Semrock發(fā)射濾光片都提供很高的阻擋 (> OD 6),因而確保了最暗的背景噪聲水平;同時,還能夠?qū)Πl(fā)射信號提供很高的透過率(平均>97%)。 值得注意的是,并非所有寬帶光源的發(fā)射濾光片都能充分阻擋激光譜線,因此可能直接降低成像對比度。 與激發(fā)濾光片一樣,發(fā)射濾光片的邊緣波長應(yīng)與相關(guān)激光譜線匹配,且短波邊緣的陡度也有嚴格要求。相 關(guān)的其它注意事項包括:應(yīng)使用*光學質(zhì)量的玻璃作為基質(zhì):自發(fā)熒光低,均勻性高,且楔角低,從而 最小化光束偏差(光束偏差會導(dǎo)致在更換濾光片時發(fā)生像素偏移)。
二向分光鏡:激光應(yīng)用的分光鏡不僅要使其透過和反射的頻帶與激發(fā)發(fā)射濾光片匹配,而且還需防反 射涂層,從而盡可能地提高發(fā)射光的穿透率和消除相關(guān)干涉影響。Semrock激光分光鏡可保證s偏振光透過 率>98%和激光波長的平均偏振>94%,即93%以上的平均透過率和透過極寬通帶(900nm-1200nm)的超低紋 波。分光鏡還應(yīng)具有類似于激發(fā)濾光片的LDT等級,且應(yīng)在反射帶上具有較低紋波,從而盡可能減小激發(fā) 光強度的變化。
由于二向分光鏡直接暴露于強激發(fā)光線中,即使是來自濾光片的弱自發(fā)熒光,都會干擾發(fā)射光的信號。 因此,應(yīng)采用超低自發(fā)熒光基質(zhì),如熔融石英。請注意,由于激發(fā)光和發(fā)射信號的強度相差多個數(shù)量級(通 常是106),對于發(fā)射濾光片,關(guān)于自體熒光的要求不會像對分色分光器的要求那么嚴格。盡管如此,在 TIRF顯微鏡中,發(fā)射濾光片的光強度級明顯高于典型的螢光廣角熒光顯微鏡中濾光片,因為TIRF系統(tǒng)中的 激光束會從樣本載玻片上*反射并沿發(fā)射路徑返回重新定向。因此,相比寬帶系統(tǒng)中的自體熒光,應(yīng)更 仔細地考慮該激光系統(tǒng)中發(fā)射濾光片的自體熒光。
在某些應(yīng)用中,二向分光鏡會對圖像質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響,尤其是在分光鏡平整度(曲率)不適合的情 況下更為明顯。即使透過波前差(TWE)受基質(zhì)曲率的影響不太明顯,反射波前差(RWE)也會對成像質(zhì)量 產(chǎn)生明顯影響。例如,當平整度不高的分光鏡置于激發(fā)光路[1]中,TIRF顯微鏡中的樣本照明可能會變?nèi)酢?同樣,由于硬涂層的固有彎曲應(yīng)力,所以可能會導(dǎo)致從分色鏡[2]反射的成像光束產(chǎn)生像差。因此,某些 應(yīng)用應(yīng)采用平整度很高的分光鏡。對于大多數(shù)激光顯微鏡應(yīng)用,分光鏡應(yīng)足夠平,這樣照明的激光束的焦 點就不會發(fā)生明顯位移,其中焦點位移通常是由瑞利范圍[1,2]來定義的。簡單來講,經(jīng)分光鏡反射的成 像光束(聚焦在探測器的陣列上,比如CCD)的合格標準是:經(jīng)分光鏡上的反射作用后,受衍射影響的光 斑尺寸不應(yīng)發(fā)生明顯變化。
多個光學濾光片組成的濾光片組:表2總結(jié)了用于激光系統(tǒng)的濾光片的關(guān)鍵特性。總的來說,濾光片最好 具有*的阻斷能力、對特定波長的光具有高透過率,同時不會影響受衍射限制的圖像質(zhì)量。這些簡單的 要求不僅會影響各個濾光片的設(shè)計,而且還會影響該組合中使用的濾光片系統(tǒng)的設(shè)計。因此,激發(fā)濾光片 和發(fā)射濾光片的設(shè)計,以及二向分光鏡的設(shè)計應(yīng)相互匹配,以獲得最高保真度的熒光可視化效果。
表2:激光成像系統(tǒng)用濾光片的關(guān)鍵特性總結(jié)。
例如,激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片的邊緣陡度是相互配合的。高邊緣陡度將對有限帶寬光的使用產(chǎn)生顯 著影響。因此,用于激光的濾光片組的激發(fā)片和發(fā)射片的分隔應(yīng)該非常小。此分隔通常小于 Semrock 激光 濾光片組中最大激光波長的 1.5%.同時,激發(fā)片和發(fā)射片的交叉邊緣位置應(yīng)具有足夠高的阻斷(> OD 6), 以確保激發(fā)光不會泄漏到發(fā)射光的通道。
二向分光鏡和發(fā)射濾光片的組合性能還會對圖像配準產(chǎn)生影響。重要的是,應(yīng)使用平整度*的玻璃 基質(zhì),以盡量減少基質(zhì)的任何楔角(鍍膜前)以及鍍層應(yīng)力導(dǎo)致的彎曲。用于熒光應(yīng)用的濾光片采用全單 基帶通濾光片結(jié)構(gòu),因此制造基質(zhì)時容易實現(xiàn)楔角的最小化(例如,激光發(fā)射片和分光鏡的楔角僅為幾弧 秒)。Semrock激光濾光片組自身就能提供出色的圖像配準性能:當相互交換這些濾光片組時,觀察不到 明顯的像素移位。通過激光濾光片組獲得的圖像不僅各熒光通道之間表現(xiàn)出極/好的圖像配準度,還能與非 熒光通道的圖像進行極/好配準(例如,微分干涉差成像(DIC)或其它明視場模式)。
對于單分子成像應(yīng)用,激光也是非常適合的光源。這類應(yīng)用要求十分嚴苛,如對發(fā)射光路混雜的激發(fā) 光要有非常嚴格的阻斷,同時最大限度地收集每一個從熒光基團發(fā)射的光子。在這種情況下,傳統(tǒng)的帶通 發(fā)射濾光片可被長波通濾光片代替(圖1). 長波通發(fā)射濾光片可從熒光基團捕獲最大信號,長波通濾光片 也可以極廣地分離了吸收和發(fā)射光譜。也有一些研究人員不使用發(fā)射片,只使用一片特定激光譜線的陷波 濾光片,因為此類濾光片能在激光器波長兩側(cè)提供最大透過率。在我們的觀察中,一些要求苛刻的應(yīng)用(尤 其是TIRF系統(tǒng))甚至可采用一個第二發(fā)射片或者采用一個陷波濾光片與各種激光濾光片組結(jié)合并達到較好 效果。采用第二濾光片(與第一發(fā)射片不相接觸)的主要目的是:確保高角度的散射激發(fā)光不會穿過整個 成像光路達到探測器[1]。
同時使用多個激光器
許多新的成像方法都基于安裝多個激光成像系統(tǒng):兩色、三色,甚至四色系統(tǒng)都是非常常見的。
樣本采用多個熒光基團進行標記,這些熒光基團需在特定條件下才能清楚地看到。因此,就有必要合 并多個激光束(多重合并,或簡稱為 MUX)或分離某一復(fù)合激光束。相對于只用于成像的二向色鏡,用于 此類應(yīng)用的二向分光鏡合并/分離具有*的要求。Semrock 的 LaserMUX™光束合成器(圖 2)提供高透過 率(透過率 R 大于 95%),以及對重要激光譜線的極優(yōu)的反射性能(反射率 R 大于 98%),從而實現(xiàn)損 失的最小化。
圖2:合并激光束進行多色成像。
上圖:描述LaserMUX™二向分光鏡如何用于合并(多重合并)或分離(多路分離)激光束。
下圖:LaserMUX濾光片的典型測量光譜。
用于同時多激光成像的激發(fā)片和發(fā)射片以及二向分色鏡特別具有挑戰(zhàn)性。帶通濾光片必須具有多個傳 輸和阻斷帶(兩色、三色,甚至四色),同時需具有上述激光濾光片的各種特性,例如:非常適合激光譜 線的高傳輸和高阻斷,高邊緣陡度和精確對應(yīng)正確的激光譜線。要求多邊緣的分光鏡能夠選擇性地從其發(fā) 射信號中分離出用于不同熒光基團的激發(fā)光。
由于有能力地生產(chǎn)多邊緣濾光片,且各邊緣都采用高陡度設(shè)計,因此可實現(xiàn)多個熒光基團的極/佳信噪 比,同時最大幅度消除熒光串色(Crosstalk)(圖 3).
圖4中顯示了可用于多種不同類型成像應(yīng)用的多激光系統(tǒng)示例。突出顯示的是不同類型的光學濾光片。 在該示例中,結(jié)合了三個激光器,且該系統(tǒng)演示了通過退掃描和非退掃描探測路徑的共焦掃描,各路徑均 可實現(xiàn)同時多顏色探測?;蛘?,如果沒有掃描功能,可與兼容TIRF的物鏡一起使用,進行TIRF成像。
圖3:Semrock四色激光濾光片組組適用于以下規(guī)格的激光器:375、405、473、488、491、559、 561、568、633、635和647納米的激光器;
藍線 - 激發(fā)濾光片,綠色 - 分色鏡,紅色 - 發(fā)射濾光片
結(jié)語
基于激光的顯微鏡成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴,在從其中獲得最高性能的過程中,光學濾光片的作 用至關(guān)重要。正確的選擇使用與其性能匹配的光學濾光片更加重要?;诩す獾某上裣到y(tǒng)的未來將會如 何?為了更好地觀察細胞或亞細胞相互作用機制,涌現(xiàn)了眾多的復(fù)雜的成像方案。例如,位于先進技術(shù)前 沿的超分辨率成像技術(shù)通常使用激光照明[3]。這些技術(shù)已經(jīng)增進了成像的分辨率,達到遠低于傳統(tǒng)顯微 鏡的衍射極限(限制到幾百納米的分辨率)。
其他的幾種熒光成像技術(shù),如 STED、PALM 和 STORM(在此不一一列舉),已證明了可以使用不同方法, 在觀察熒光標記樣本時達到幾十納米的分辨率。這些成像技術(shù)的前提是基于能準確定位單個熒光分子。由 于定位的精度隨著從給定熒光基團分子[4]獲得的光子數(shù)增加而顯著增加,高效的光學濾光片在這些前沿 應(yīng)用中發(fā)揮了日益重要的作用。
圖4:復(fù)雜多激光器成像系統(tǒng)示例。特定激光濾光片為藍色突出顯示。
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